Bioquimica Clinica

Universidad de Oriente
Núcleo Bolívar
Escuela de Ciencias de la Salud “Francisco Battistini Casalta”
Laboratorio de Bioquímica Clínica.










Perfil Enzimático Hepático.
Método UV optimizado (IFCC) para la determinación de Alanina Aminotransferasa (ALT/GPT) y Aspartato Aminotrasferasa (AST/GOT), en suero









Bachiller: Angélica González
Profesor: German Guzmán



Cuidad Bolívar, Mayo del 2008

Índice

Introducción...02
Perfil Enzimático Hepático...03

Fundamentos del Método

Reactivos provistos

Instrucciones para su uso

Precauciones
Muestra
Indicios de inestabilidad

Instrucciones de almacenamiento

Material requerido
Condición de la reacción
Procedimiento
ResultadosBibliografía...08

Introducción

Para la evaluación del funcionamiento hepático se utilizan pruebas para averiguar el estado general del hígado y del sistema biliar. Las pruebas rutinarias de función hepática pueden dividirse entre las que son valores reales de la función hepática, como seroalbúmina o tiempo de protombina; y aquellas que son simplemente marcadores de la enfermedad hepática o del sistema biliar, como las diferentes enzimas hepáticas. Además de las pruebas hepáticas usuales que se obtienen a través de los paneles automatizados de químicas serológicas rutinarios, los médicos podrían ordenar pruebas hepáticas más específicas, como las pruebas de serología viral o las pruebas autoinmunes que, cuando son positivas, pueden determinar la causa específica de una enfermedad hepática.

Existen dos categorías generales de enzimas hepáticas. El primer grupo incluye las enzimas transaminasas: alaninoaminotransferasa (ALT) y la aspartato aminotransferasa (AST), antes conocidas como GPT y GOT respectivamente. Estas son enzimas indicadoras del daño a la célula hepática. El segundo grupo incluye ciertas enzimas hepáticas, como la fosfatasa alcalina y la gammaglutamiltranspeptidasa (GGT) las cuales indican obstrucción del sistema biliar, ya sea en el hígado o en los canales mayores de la bilis que se encuentran fuera de este órgano.
Las ALT y AST son enzimas en las células hepáticas que permean hacia la circulación sanguínea cuando existe daño en la célula hepática. Se cree que la ALT es un indicador más específico de la inflamación hepática, mientras que la AST puede aparecer elevada en enfermedades de otros órganos, como el corazón o el músculo. En caso de daño severo en el hígado, como en la hepatitis viral aguda, la ALT y la AST pueden estar elevadas. En la hepatitis viral aguda o en la cirrosis, el aumento de estas enzimas puede ser mínimo (menos de 2-3 veces de lo normal) o moderado,

Aumentos leves o moderados de la ALT o la AST son no-específicos y pueden estar causados por una extensa gama de enfermedades hepáticas. La ALT y la AST son a menudo usadas para valorar el avance de la hepatitis crónica, y la respuesta al tratamiento con corticosteroides e interferón.

Donde los valores expresados de la ALT y AST son en unidades catalíticas, las cuales dependerán del Kit de la casa comercial a utilizar y la temperatura de la reacción ya sea 25º, 30º o 37ºC
Siendo parte del perfil hepático y este no es mas que un conjunto de exámenes de sangre que indican si su hígado está funcionando bien. El hígado se encuentra en el abdomen y está ubicado cerca de su estómago. Es un órgano muy importante, porque descompone y almacena algunas sustancias como el azúcar, la grasa y las vitaminas. El hígado también remueve las drogas y otros químicos de su cuerpo. Los exámenes incluidos en los perfiles hepáticos varían de acuerdo a los laboratorios. Una lista común de exámenes incluye la búsqueda de enzimas hepáticas que provienen de los tejidos hepáticos dañados. Una enzima, es algo que ayuda a acelerar una reacción química en su cuerpo. Otras pruebas pueden buscar las sustancias producidas o cambiadas por el hígado, como son las proteínas o la bilirrubina.

Perfil Enzimático Hepático

“Determinación de Alanita Aminotransferasa (ALT), en suero”.

Inserto de la Casa Comercial: “Wiener Lab”. Unitest.


Fundamento del método

La ALT o GPT, cataliza la siguiente reacción:

L- alanina + 2-oxoglutarato----GPT piruvato + L- glutamato

Piruvato + NADH + H+ ----LDH L- lactato + NAD+

Reactivos provistos

-La solución buffer TRIS a pH 7.5 (30ºC) , contiene L – alanita
-Sustrato viales: contiene 2-oxoglutarato, nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) y lactato deshidrogenasa (LDH).

Instrucciones para su uso

-El buffer esta listo para usar
-El sustrato, se le debe agregar 2 ml de buffer. Tapar, agitar hasta obtener una disolución completa. Indicar fecha de preparación y vencimiento
-La muestra debe ser tomada de forma usual

Precauciones

-Los reactivos son de uso “in vitro” y la solución buffer contiene Azida que es un material potencialmente peligroso, ya que puede reaccionar con tuberías y desagües de plomo o cobre, dando lugar a azidas metálicas altamente explosivas.

Muestra

Suero o plasma
-Si la muestra a utilizar es plasma se debe usar heparina como anticoagulante
-No utilizar muestras hemolizadas



Indicios de inestabilidad

-Cuando el espectrofotómetro ha sido llevado a cero con agua destilada
-Sustancias interferentes:
Las muestras con hemólisis visible o intensa producen valores falsamente aumentadas por lo que no deben ser usadas.
Las muestras con concentraciones de cetoácidos endógenos particularmente elevadas producen valores falsamente aumentados
Las muestras de paciente hemodializados o con hipovitaminosis u otras patologías asociadas con deficiencia de piridoxal fosfato producen valores falsamente disminuidos

Instrucciones de almacenamiento

-Reactivos provistos: son estables en refrigeración de 2-10°C, hasta la fecha de vencimiento indicada en la etiqueta
-Sustrato reconstituido: estable 5 días en refrigerador (2-10°C), o un (1) día a temperatura ambiente
-Muestra: el suero es estable hasta 3 días en refrigerador (2-10°C), sin conservante. No congelar

Material requerido

-Espectrofotómetro
-Micropipetas
- Pipetas
-Tubos de ensayos
-Baño de agua a la temperatura indicada en el procedimiento a seguir, esto es si se utiliza un aparato manual.
-Cronometro

Condición de la reacción

Disminución de Absorbancia
-Longitud de onda: 340 nm (Hg 334 ó 366)
-Temperatura de reacción: 37°C
-Factor de calibración: 1740
-Los volúmenes de muestra y de sustrato reconstituido: pueden reducirse proporcionalmente, sin que varíen los factores de cálculo correspondiente

Procedimiento

Nota: Va a depender si el aparato utilizado es manual, semi automatizado o automatizado.

Para el desarrollo de esta técnica, la temperatura de reacción es de 37°C, tiempo de reacción 4 minutos y el factor de calibración es de 1740. Aparato semi automatizado (# de la prueba 21)

Microtécnica

En una cubeta mantenida a 37 ºC, colocar:

Sustrato reconstituido --------------1 ml

Muestra---------------------------100 ul


Mezclar inmediatamente y disparar simultáneamente el cronometro. Una vez mezclada se lee en el aparato y registrar la abs, al minuto luego 2, 3 y 4 min.
Como este es un equipo semi automatizado(METROLAB-Wiener), realiza el mismo los cálculos y nos da el valor de los resultados.


Cálculo de los resultados

Luego se determina la diferencia promedio, restando cada lectura de la anterior y promediando los valores (DAbs /min). Y se utiliza este promedio para los cálculos de los resultados.
X/4= DeltaAbs/min


Resultado


Valor de referencia 37°C (ALT/GPT)
Hombre: 0-41 U/I
Mujer: 0-31 U/I


Paciente: Jesus Gonzalez
Edad: 50 a
Valor obtenido (ALT/GPT) 37°c = 13.85 UI/L


“El resultado obtenido (ALT= 13.85UI/ 37°c) es del paciente Jesus Gonzalez.
Cuyo valor se ubica dentro de los valore de referencia, pero para un diagnostico especifico se sugiere realizar un perfil enzimático completo (gGT, LD, 5’NT) y un perfil hepático. Para evaluar el funcionamiento Hepático y descartar una hepatopatia o diagnosticarla”

“Determinación de Aspartato Aminotransferasa (AST o GOT), en suero.”

Fundamento del método

La AST o GOT, cataliza la siguiente reacción:

L- aspartato + 2-oxoglutarato GOT oxalacetato + L- glutamato

Oxalacetato + NADH + H* MDH L- malato + NAD*

Reactivos provistos

-Solución buffer TRIS pH 7.8 (30ºC) conteniendo L – aspartato
-Sustrato viales: conteniendo 2-oxoglutarato, nicotamida adenina dinucleotido (NADH) y malato deshidrogenasa (MDH) y lactato deshidrogenasa (LDH).

Instrucciones para su uso

-El buffer esta listo para usar
-El sustrato: agregar 2 ml de buffer a un frasco de sustrato. Tapar, agitar hasta disolución completa y fechar.
-La muestra debe ser tomada de forma usual

NOTA: LA DETERMINACIÓN DE AST/GOT CUBRE LAS MISMAS CONDICIONES TOMADAS PARA LA DETERMINACIÓN DE AST/GPT EN SUERO

Material requerido

-Espectrofotómetro
-Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados
-Baño de agua a la temperatura indicada en el procedimiento a seguir
-Cronometro

Procedimiento

Microtécnica

En una cubeta mantenida a 37 ºC, Fc=1740 colocar:

Sustrato reconstituido -------------1 ml
Muestra ---------------------------100 ul

Mezclar inmediatamente y dispara inmediatamente el cronometro y leer al minuto luego 2, 3 y 4 min.


Resultado


Valor de referencia 37°C (AST/GOT)
Hombre: 0-38 U/I
Mujer: 0-31 U/I
Paciente: Jesus Gonzalez
Edad: 50 a
Valor obtenido (AST/GOT)= 20.12 UI/L 37°c




“Los valores obtenidos en la determinación en suero de ALT y AST, del paciente Jesus Gonzalez están dentro de los valores de referencia, pero si se desea descartar una hepatopatia se sugiere realizar otras pruebas para dar un diagnostico definitivo de la función hepática”

Bibliografía

Inserto de la “Casa Comercial Wiener Lab”. GPT/ALT y GOT/AST. Unitest. Bioquímica
http://www.wiener-lab.com.ve