Perfil lipidico

Universidad de Oriente

Núcleo Bolívar

Escuela de Ciencias de la Salud “Francisco Battistini Casalta”

Laboratorio de Bioquímica Clínica.

Perfil lipídico

Bachiller: Angélica González

Profesor: German Guzmán

Cuidad Bolívar, Junio del 2008

Índice

Introducción…02

Fundamento del método…03

Reactivos…04

Material requerido…05

Muestra…08

Sustancias interferentes…10

Limitaciones del método…13

Procedimiento…13

Calculo de resultado…14

Resultado…15

Bibliografía…16

Introducción

El perfil lipídico lo constituye la cuantificación analítica de una serie de lípidos que son transportados en la sangre por los diferentes tipos de lipoproteínas plasmáticas. La determinación de estos parámetros es un procedimiento analítico básico para el diagnóstico y seguimiento de enfermedades metabólicas, primarias o secundarias. Entre estos parámetros analíticos que se pueden determinar están: el colesterol total, el colesterol transportado por las LDL, el colesterol transportado por las HDL, los triglicéridos totales, ciertas apoproteínas particulares etc.

El perfil lipídico incluye el colesterol total, el HDL-colesterol, el LDL-colesterol y los triglicéridos. Algunas veces, el informe incluirá valores adicionales calculados como la relación HDL/colesterol o cálculos basados en los resultados del perfil lipídico, edad, sexo y otros factores de riesgo.

La cuantificación de colesterol y triglicéridos en suero es un procedimiento analítico básico en el diagnóstico y seguimiento de enfermedades metabólicas, primarias o secundarias. Altos niveles de colesterol se asocian a riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares. En esta práctica se realizará la determinación en suero de colesterol total, colesterol-HDL y triglicéridos.

Altos niveles de colesterol se asocian a riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares, en especial aquel unido a las LDL (colesterol malo). El colesterol de las HDL (colesterol bueno), puesto que representa aquella fracción de colesterol que se transporta al hígado para su metabolización y excreción por vía biliar, no se asocia con riesgo de enfermedad.

Los objetivos de la práctica son la determinación en suero de colesterol

Los triglicéridos son el principal tipo de grasa transportado por el organismo. Recibe el nombre de su estructura química. Luego de comer, el organismo digiere las grasas de los alimentos y libera triglicéridos a la sangre. Estos son transportados a todo el organismo para dar energía o para ser almacenados como grasa.

El hígado también produce triglicéridos y cambia algunos a colesterol. El hígado puede cambiar cualquier fuente de exceso de calorías en triglicéridos.

Los niveles de triglicéridos varían con la edad, y también dependen de qué tan reciente ingirió alimentos antes del examen. La medición es más precisa si no se ha comido en las 12 horas previas al examen. El valor normal es de 150 mg/dL. Para quienes sufren problemas cardiacos, los niveles de esta sustancia deben ser inferiores a los 100 mg./dl.

Los triglicéridos altos además se encuentran presentes en los alimentos y en la sangre.

Si el colesterol tiene un valor normal, un nivel elevado de triglicéridos no parece ser un factor de riesgo de enfermedad cardiaca, pero sí puede ser riesgoso al asociarse con diabetes y pancreatitis.

Cuando la persona come, los triglicéridos se combinan con una proteína en su sangre para formar lo que se llama lipoproteínas de alta y baja densidad. Estas partículas de lipoproteínas contienen colesterol. Para formar triglicéridos en el hígado el proceso es similar; el hígado toma los carbohidratos y proteínas sobrantes de la comida y los cambia a grasa. Esta grasa entonces se combina con proteína y colesterol para formar lipoproteínas de muy baja densidad, que son liberadas al torrente circulatorio.

Los objetivos de la práctica son la determinación en suero de colesterol total, HDL-Colesterol y triglicéridos, para lo que se utilizarán kits comerciales

Determinación de colesterol total

Fundamentos del Método.

Inserto de la Casa Comercial Laboratorios Biogamma C.A.

Colesterol Total.

Para la determinación de colesterol total se utilizan reactivos comerciales que incluyen las enzimas y sustratos necesarios para la cuantificación de todas las formas de colesterol presentes en el suero (Kit comercial de Biogamma C.A. Colesterol Total.

La determinación del colesterol total esta basado en el procedimiento enzimático (descrito por Allan):

Colesterol esterasa

Esteres de colesterol=====Colesterol Libre + Ácidos Grasos

Colesterol oxidasa

Colesterol Total + Oxigeno=====Colest- 4- en -3- one + H₂O₂

Peroxidasa

Fenol + 4-aminoantipirina + 2 H₂O₂₌₌₌₌₌Cromoforo de quinoneimina + 4H₂O

Reactivos usados

-Reactivo enzimático. Contiene: 4- aminoantipirina, Fenol, Colesterol Estearasa, Colesterol Oxidasa, Peroxidasa, activadores, estabilizadores y Buffer. Condiciones: refrigerado entre 4-8 ºC.

-Estándar de Colesterol (200 mg %): es una solución de colesterol monometil etilenglicol, y activadores. Condiciones: refrigerado entre 4-8 ºC, o a temperatura ambiente (25 ºC)

Precaución: las soluciones de estándar son venenosas si son absorbidas a través de la piel y muy peligrosa si se inhalan sus vapores. Lave las manos vigorosamente después de su uso.

Muestra.

-Suero recién extraído y no hemolizado. También se pueden usar plasma obtenido con EDTA.

El colesterol en suero o plasma es estable:

-Por 5 día a temperatura ambiente.

-2 semanas refrigeradas

-6 meses si se congela.

Recomendaciones: Un ayuno de 12-14horas antes de la extracción de la muestra, sobre todo si también se le va hacer la determinación de triglicéridos a la misma muestra. Sin no cumplen este requisito no deben usarse para determinar colesterol y HDL-Colesterol.

Limitaciones del Método.

-Niveles de ácido ascórbico tan altos como 10 mg %, No Interfieren en la prueba

-El presente método de Colesterol, á demostrado ser lineal hasta 500 mg/dl. Mas allá de este límite, las muestras deberán diluirse con solución salina (0,85%) y ensayadas nuevamente. El nuevo resultado deberá multiplicarse por el factor de dilución

Procedimiento del método.

-Marcar 3 tubos: Tubo 1 para la muestra (M), Tubo 2 para el estándar de referencia (ER) y Tubo 3 para blanco reactivo (BR).

-A cada tubo (1, 2 y 3) agregar 1 ml de reactivo de colesterol.

-Pipetear 0,010 ml de la muestra y agregar al tubo 1. Tape y mezcle por inversión.

-Pipetear 0,010 ml de estándar de colesterol total y agregar al tubo 2. Tape y mezcle por inversión.

-Pipetear 0,010 ml de agua destilada y agregar al tubo 3. Tape y mezcle por inversión.

-Incubar todos los tubos a 37 ºC por 5 minutos en baño de maría, o 15 minutos a temperatura ambiente.

-Después de incubar, mezclar por inversión cada tubo y lea en el espectrofotómetro dentro de los 30 minutos siguientes.

-Leer a 500 nm, llevar a 0% abs., con el blanco reactivo. Leer el tubo 1 y 2 y anotar las Absorbancias. (esto dependerá del equipo utilizado, algunos dan las concentraciones del analito en estudio).

-Se utilizo un aparato manual (génesis)

Nota: control de calidad se recomienda el uso de sueros controles normales y anormales, comerciales de calidad reconocida.

----------------Muestra------------Estándar-----------Blanco reactivo

Muestra-----0.010ml------------------------------------------------------

Estándar----------------------------0.010ml-------------------------------

Reactivo--------1ml-------------------1ml-----------------1ml-----------

colesterol

Determinación de HDL-colesterol

Para la determinación del colesterol presente en las principales lipoproteínas que lo contienen como HDL (lipoproteínas de alta densidad) y LDL (lipoproteínas de baja densidad), es necesario:

1, la separación selectiva de la lipoproteína correspondiente con agentes precipitantes.

2, la cuantificación del colesterol presente en dicha lipoproteína como se indicó anteriormente.

Este es un procedimiento de separación únicamente, para determinar los valores de HDL colesterol, se debe utilizar 0.050ml del sobrenadante obtenido por este procedimiento del colesterol total

-Pipetear 0.5ml de la muestra y agregar en un tubo

-Agregar 0.05ml de reactivo precipitante

Entre estos reactivos precipitantes están el ácido fosfotungstico y magnesio que precipitan a las LDL y VLDL (lipoproteínas de muy baja densidad) mientras que las HDL permanecen en solución

-Agitar vigorosamente

-Reposar en el refrigerador por 15 minutos

-Centrifugar por 10 minutos entre 3500-4000rpm

-Y del sobrenadante tomar los 0.050 ml de muestra para determinarle HDL= colesterol

Esquema de trabajo

----------------Muestra------------Estándar-----------Blanco reactivo

Muestra-----0.050ml------------------------------------------------------

Estándar----------------------------0.050ml-------------------------------

Reactivo--------1ml-------------------1ml-----------------1ml-----------

Colesterol

Mezclar e Incubar 5 min a 37ºC (ó 10 min a temperatura ambiente).

Leer la absorbancia a 505 nm.

Determinación de triglicéridos

Para la determinación de triglicéridos en suero se utilizan reactivos comerciales (Kit comercial de CHEMROY) que incluyen las enzimas y sustratos necesarios para la cuantificación por espectrofotometría visible.

Fundamento del método

Para la determinación colorimetrica cuantitativa enzimático de triglicéridos en suero o plasma

Para establecer el diagnostico de hiperlipoproteinemia primaria o secundaria, es muy útil la cuantificación de triglicéridos en conjunto con otros lípidos.

También es útil para dar seguimiento a la diabetes mellitus, nefrosis, obstrucción biliar y varias anormalidades metabólicas que resultan de disturbios endocrinos

Las reacciones que tienen lugar son:

Lipasa

Triglicéridos + H2O=====Glicerol + Ac. Grasos

GK

Glicerol + ATP====Glicerol-3-P + ADP

GPOD

Glicerol-3-P + O2====Dihidroxiacetona + H2O2

POD

H2O2 + p-clorofenol + 4-AP====Quinona + H2O

1. Una lipasa hidroliza los triglicéridos dando glicerol mas ácidos grasos libre.

2. El glicerol formado es sustrato de una glicerol quinasa que en presencia de ATP lo f osforila a glicerol 3P.

3. El glicerol 3P es oxidado a dihidroxiacetona por una glicerol fosfato oxidasa dando también peróxido de hidrógeno.

4. El peróxido de hidrógeno junto con los cromógenos p-clorofenol y 4-AP son sustrato de una peroxidasa para formar una quinona roja cuantificable a 505 nm. La quinona formada es proporcional a la concentración de triglicéridos presente en la muestra.

Reactivo

-Triglicéridos reactivo

-Triglicéridos activador

-Estándar triglicéridos 200 mg/dl

Precauciones

-Uso de diagnostico in Vitro

-Los reactivos y el estándar contienen azida de sodio como conservador

Material requerido

-Espectrofotómetro

-Baño de maria a 37’C

Muestra

-La heparina y EDTA son los anticoagulantes de elección.

-No deben usarse fluoruros ni oxalatos. Separa el suero o el plasma

-Los TG son estables por 10 días a 2-8’C

-No deje las muestra a temperatura ambiente, ya que los fosfolipidos pueden hemolizarse liberando glicerol libre, falsamente aumentados los TG

Sustancias interferentes

-No debe usarse material que contenga glicerina

-Muestras hemolizadas

Procedimiento

Esquema de trabajo

----------------Muestra------------Estándar-----------Blanco reactivo

Muestra-----0.01ml------------------------------------------------------

Estándar----------------------------0.010ml-------------------------------

Reactivo--------1ml-------------------1ml-----------------1ml-----------

Mezclar e Incubar a 37ºC 5 min (ó 10 min a temperatura ambiente). Leer la absorbancia a 505 nm de la Mx y St

Nota: Control de calidad se recomienda el uso de sueros controles normales y anormales, comerciales de calidad reconocida

Calculo de los resultados

Datos

Conc ST colest = 200mg/dl

Abs ST colest = 0.153 Abs

Abs Mx colest= 0.112Abs

Conc ST HDL-C= 50mg/dl

Abs ST HDL-C= 0.284 Abs

Abs Mx HDL-C= 0.136 Abs

Abs ST TG= 0.280 Abs

Abs Mx TG= 0.150 Abs

Determinacion de colesterol total

Conc Mx (mg/dl)= Conc. ST/Abs. ST*Abs Mx

Conc. Mx (mg/dl)= 200mg/dl/ 0.153*0.112 = 147 mg/dl

Determinacion de HDL-C

Conc HDL-C = Conc ST/Abs ST*Abs Mx

Conc HDL-C= 50mg/dl/0.284*0.136= 24 mg/dl

Determinación de VLDL-C

VLDL-C= TG/5= 107/5= 21 mg/dl

Determinación de LDL-C

LDL-C= Colest total – HDL- VLDL

LDL-C= (147-24 - 21) mg/dl = 102mg/dl

Colest total= HDL-C + LDL-C + VLDL-C

Colest total= (24 + 21+ 102)mg/dl = 147 mg/dl

Determinación de Triglicéridos

Conce TG sericos = Abs Mx/ Abs St* 200

Conce TG sericos =0.150/0.280*200=107 mg/dl

A partir de tos datos de colesterol total, triglicéridos y colesterol HDL fueron calculados colesterol VLDL y colesterol LDL

Valores normales colesterol total

Deseable menos de 200 mg/dl

Limite alto: 200-239mg/dl

Alto: 240 o por encima mg/dl

Resultados

Paciente 001

Edad: 29 a

Sexo: femenina

Perfil lipidico

==========Valor obtenido =========Unidades============Valor de referencia

Colesterol total=== 147 ==============mg/dl ===============150-250 mg/dl

Triglicéridos===== 107 =============mg/dl ================50-140 mg/dl

VLDL-C ======= 21 ==============mg/dl ================16- 36mg/dl

LDL-C ======== 102 =============mg/dl ================83-140mg/dl

HDL-C ======== 24 ============= mg/dl ================39- 43mg/dl

Laboratorio de bioquímica clínica

El perfil lipidico realizado a la paciente femenina de 29años de edad dio como resultados valores que están dentro de los intervalos de referencia de colesterol total, triglicéridos, VLDL, LDL y HDL-C. Siendo el perfil lipidico de esta paciente normal. Estando el colesterol dentro de los valores esperados menos de 200mg/dl

Teniendo en cuenta que los valores de referencia sin hacer discriminaciones por edad son: Sexo Femenino de HDL, LDL y VLDL-C están dentro de los valores esperados

Las determinaciones de lipoproteínas de baja densidad (LDL) se utilizan como herramientas diagnósticas en la evaluación del riesgo de cardiopatía coronaria.

Existe variabilidad de los diferentes componentes del perfil lipídico en relación a la edad y sexo. De allí la importancia de que en el estudio de cada individuo sean tenidas en cuenta como mínimo estas dos variables

Bibliografía.

-Inserto de Laboratorios Biogamma C.A. Química Sanguínea. Caracas- Venezuela: Edif. Frangiu, La Trinidad, Calle Bolívar No. 27 1er piso, local 1-A. TLF:945. 80. 24. E-mail: Biogamma@ cantv. Net

-Inserto de Laboratorios CHEMROY. Triglicéridos proced.No. CR315

Enzima cardiaca

Universidad de Oriente

Núcleo Bolívar

Escuela de Ciencias de la Salud “Francisco Battistini Casalta”

Laboratorio de Bioquímica Clínica.

Perfil Enzimático para la valoración del Infarto Agudo de Miocardio

Determinación de CK.MB

Bachiller: Angélica González

Profesor: German Guzmán

Cuidad Bolívar, Junio del 2008

Índice

Introducción…02

Fundamento del método…03

Reactivos provistos…03

Instrucciones para su uso…03

Precauciones…04

Instrucciones de almacenamiento…04

Muestra…04

Material requerido…04

Condiciones de reacción…04

Procedimiento…04

Calculo de resultado…04

Valores de referencia…05

Resultado…05

Bibliografía…05

Introducción

La creatina quinasa es una enzima dimérica compuesta por dos tipos de subunidades monoméricas, M (Muscular) y B (Cerebral). Las subunidades se combinan para formar tres isoenzimas CK distintas, CK-BB (CK-1), CKMB (CK-2) y CK-MM (CK-3). CK MM es la forma predominante de CK en los músculos esqueléticos. CK-BB se encuentra en el cerebro y en los músculos esqueléticos. CK-MB se encuentra en alta concentración en el miocardio (entre 14 y 42%) y en menor proporción en los músculos esqueléticos. En ausencia de enfermedad, la mayor parte de la actividad de la CK en el suero se debe a la isoforma CK-MM.

Los daños en el miocardio, como los presentes en el infarto de miocardio agudo (IMA), tendrán como resultado un aumento de los niveles circulatorios de la isoforma CK-MB.

Generalmente los niveles de CK-MB aumentan entre 4 y 6 horas después de la aparición del dolor de pecho, alcanzando un pico entre las 12 y 24 horas y volviendo a los niveles iniciales antes de 48 horas. En los casos en los que existan sospechas de un IMA; se recomienda la determinación de CK-MB, generalmente en el momento del ingreso y 6 horas, 12 horas y 24 horas más tarde.

Se encuentran disponibles varios métodos para la separación y cuantificación de CK-MB mediante electroforesis e inmunoinhibición. Los métodos de inmunoinhibición presentan la ventaja de que se pueden automatizar fácilmente. El método CK-MB de Thermo Scientific utiliza un método de inmunoinhibición. El reactivo contiene una mezcla de anticuerpos monoclonales al monómero CK-M y así inhibe por completo la actividad de CK-MM y la mitad de la actividad de CK-MB. Se mide la actividad de la subunidad monomérica B no inhibida de CK-MB, la cual representa la mitad de la actividad de CK-MB. El método asume que la actividad de la isoenzima CK-BB en suero es prácticamente cero. En este método, se añade suero a un reactivo de CK-NAC modificado que contiene el anticuerpo anti-M.

Durante la incubación inicial tienen lugar las siguientes reacciones:

CK-MM + anticuerpo ————> CK-MM inhibida

CK-MB + anticuerpo ————> CK-MB inhibida al 50%

Fundamento del método

Método UV para la determinación de la isoenzima MB de cretina kinasa en suero o plasma mediante anticuerpos monoclonales anti CK-M

El método se basa en la inhibición específica de las unidades CK- M con anticuerpos monoclonales anti CK- M, los anticuerpos inhiben tanto la isoenzima MM como las subunidades M correspondientes a CK- MB. Las subunidades B se determinan mediante el empleo de un sistema reactivo basado en una técnica analítica optimizada por la IFCC, con N acetilcisteina como activador adicionado de anticuerpos monoclonales anti CK- M.

Reactivos provistos

-Buffer: solución de buffer imidazol, 100 mmol/l, pH 6,7

-Sustratos viales: para determinaciones individuales conteniendo cantidades suficientes una vez reconstituido.

-Suero control: vial conteniendo suero liofilizado.

Instrucciones para su uso

-Buffer: listo para usar.

-Sustrato: agregar 2,5 ml de buffer a un vial de sustrato. Agitar y etiquetar.

-Suero control: pipetear 1 ml de agua destilada y agregar al vial de suero liofilizado. Tapar y esperar 5 minutos para su uso.

Precauciones

-Los reactivos son para uso in Vitro.

-Suero control: debe ser tratado como material infectivo, a pesar de que ha sido analizado para HIV y HBV siendo no reactivo.

Instrucciones de almacenamiento

-Reactivos provistos: estables en refrigerador 2-10º C, hasta la fecha de vencimiento

-Sustrato reconstituido: refrigerado de 2-10º C, es estable 3 días a partir del momento de su reconstitución

-Suero control reconstituido: estable 3 días refrigerado 2-10º C, 2 días a 25º C o 3 meses congelado -20º C. No congelar y descongelar repetidamente.

Muestra

-Suero o plasma

-Si se utiliza plasma se debe utilizar heparina o EDTA como anticoagulante, o el empleo de anticoagulante W de Wiener Lab.

-Interferencia: sueros con hemolisis producen valores falsamente aumentados.

Material requerido

-Espectrofotometro.

-Micropipetas y pipetas.

-Baño de maría.

-Cronómetro.

Condiciones de reacción

-Longitud de onda: 340 nm, 334 o 366 Hg.

-Temperatura de reacción: 25, 30 o 37 ºC.

-Tiempo de reacción: 15 minutos.

Procedimiento

Sustrato reconstituido-------------------------------- 2,5 ml

Pre- incubar por unos minutos.

Muestra---------------------------------------------- 0,10 ml

-Mezclar por inversión, esperar 10 minutos.

-Llevar el aparato (Genesis) a 0 con agua destilada.

-Seleccionar la longitud de onda y la temperatura de reacción.

-Registrar las absorbancias cada minuto (disparar el cronómetro) durante 5 minutos.

-Determinar la diferencia promedio.

Cálculos de los resultados

CK- MB (U/L) = Delta D Abs/min* Factor

Medida a 340 nm = CK- MB (U/L) = Delta D Abs/min* 8254

Medida a Hg 334 = CK- MB (U/L) = Delta D Abs/min* 8414

Medida a Hg 366 = CK- MB (U/L) = Delta D Abs/min* 14858

Los valores mencionados ya tienen la corrección para convertir los valores de CK- B en CK- MB

Se trabajo manual con el génesis a 25ºC

1º minuto= 0,157 Abs

2º minuto= 0,159 Abs

3º minuto= 0,170 Abs

4º minuto= 0,172 Abs

5º minuto= 0,173 Abs

Delta Abs

1 = 0,173 - 0,172 = 1 x 10^-3

2 = 0,172 – 0,170 = 2 x 10^-3

3 = 0,159 – 0,157 = 2 x 10^-3

Delta Abs/ minuto = (1 + 2 + 2) x 10^-3/ 5 = 5 x 10^-3 = 1x10^-3 * 8254 = 8 U/L

Valores de Referencia

Temperatura: 25 ºC----------------------------- 30 ºC ------------------------- 37 ºC

Valores: 10 U/L--------------------------- 16 U/L------------------------ 25 U/L

Resultados

Nombre y Apellido: Fanny R

Edad: 23a

Valores Obtenidos CK-MB ------------valor--------unidades-----------valor de referencia

CK-MB----------------------------------8-------------U/L 25ºC--------10U/L 25ºC

La creatina quinasa ( CK ) es una isoenzima presente en el músculo ( CK-M ) y en el cerebro
(CK-B), y existe en el suero en forma de dimeros como CK-MM, CK-MB, CK-BB, y macroenzimas. La determinación de CK-MB es bastante específica para la confirmación de daños en el músculo cardíaco, siendo que la CK-BB está prácticamente ausente del suero y la CK-MM es abundante, dado su origen muscular.

Así la CK-MB es clínicamente utilizada para el diagnostico y monitorización de infarto de miocárdico. Y los resultados obtenidos en la dertminacion de CK.MB para la paciente fanny R, fue de 8U/L cuyo valor esta dentro de los valores de referencia (10U/L 25ºc) de CK.MB

La reacción para CK-MB consiste en la determinación directa de la actividad enzimático de la CK-B, después de la inhibición especifica de sus subunidad CK-M , en la CK-MM, i CK-MB. Esta inhibición se consigue a través de la unión de anticuerpos policlonales específicos del reactivo, que bloquean el sitio activo de la enzima, inhibiendo así su actividad.

En algunas ocasiones, debido a la naturaleza de la muestra analizada, y la composición del reactivo, los resultados pueden sufrir interferencias por reacciones inespecíficas con la subunidad CK-B.

Estas interferencias (sueros lipemicos, hemolizados…) generan resultados alterados, y no muestran el mejor comportamiento de la determinación.

Bibliografía

-Inserto CK- MB NAC. Unitest. Monoclonal. Wiener Lab 2000. Rosario- Argentina

Prueba de Tolerancia a la Glucosa Oral

Universidad de Oriente
Núcleo Bolívar
Escuela de Ciencias de la Salud “Francisco Battistini Casalta”
Laboratorio de Bioquímica Clínica.









Prueba de la tolerancia de la glucosa Curva de la tolerancia a la Glucosa














Bachiller: Angélica González
Profesor: German Guzmán







Cuidad Bolívar, Junio del 2008





Índice


Introducción…02
Glucosa sérica…05
Prueba de la tolerancia a la glucosa…05
Utilidad de la glucemia en el diagnostico medico…06
Condiciones de la muestra…07
Condiciones del paciente…07
Fundamentos del método…08
Reactivos…08
Procedimiento…09
Valores normales..10
Resultado…10
Bibliografía…11

Introducción

La glucosa es la principal fuente de energía para el metabolismo celular. Se obtiene fundamentalmente a través de la alimentación, y se almacena principalmente en el hígado, el cual tiene un papel primordial en el mantenimiento de los niveles de glucosa en sangre (glucemia). Para que esos niveles se mantengan y el almacenamiento en el hígado sea adecuado, se precisa la ayuda de la insulina, sustancia producida por el páncreas. Cuando la insulina es insuficiente, la glucosa se acumula en sangre, y si esta situación se mantiene, da lugar a una serie de complicaciones en distintos órganos. Esta es la razón principal por la que se produce aumento de glucosa en sangre, pero hay otras enfermedades y alteraciones que también la provocan.

Por tanto, la determinación de glucosa en sangre (glucemia) es útil para el diagnóstico de numerosas enfermedades metabólicas, fundamentalmente de la diabetes mellitus. También es necesaria esta prueba, una vez diagnosticada la diabetes, para controlar la dosis de insulina que se debe administrar para tratarla.

Después de un ayuno de varias horas y en condiciones de reposo la concentración de glucosa en sangre es de 65 a 100 mg por 100 ml. Después de la ingestión de alimentos, sobrevienen alzas hasta de 120 a 140 mg por 100 ml y, unas horas después, regresan a los valores en ayunas.
Este es un ejemplo de ajuste fisiológico constante para conservar la concentración de glucosa en los líquidos sin grandes cambios.

De la misma manera, la modificaciones producidas por las emociones violentas, el ejercicio intenso y la aún inanición, son equilibradas para volver a lo normal.
Si la glucosa de la sangre se mantiene dentro de los limites estrechos, es porque la serie de fenómenos que concurren a proporcionar glucosa a la sangre se equilibran con los mecanismos que la sustraen de ella.

En ayunas, la única fuente de glucosa sanguínea es el hígado.

La velocidad de formación y degradación del glucógeno hepático es uno de los factores más importantes en la regulación de la glicemia. Como la salida de glucosa del hígado depende, en gran parte, de la concentración de glucosa en la sangre, cuando ésta se modifica, funciona el mecanismo glucogénico, o por el contrario, el glucogenolítico, debido a las hormonas relacionadas:
La insulina, que favorece la utilización y captación de glucosa y es secretada al elevarse la glucemia, el glucagón y la epinefrina, impulsores de la glucogenólisis, y son secretados por el páncreas y glándulas suprarrenales cuando hay hipoglucemia.

La hormona insulina tiene gran importancia en la participación de la regulación de glucosa sanguínea, se produce en las células Beta del páncreas en respuesta a la hiperglucemia, la administración de insulina produce hipoglucemia inmediata. La adrenalina y la noradrenalina impiden la liberación de la insulina.

Por otro lado, el glucagón se opone a la acción de la insulina, es producido en las células A del páncreas y es secretado cuando hay hipoglucemia llegando a través de vena porta al hígado para producir glucogenólisis y gluconeogénesis.

Otras hormonas influyen en la hiperglucemia como la hormona del crecimiento que inhibe la utilización de la glucosa y favorece la de ácidos grasos, los glucocorticoides que aumentan la gluconeogénesis, la adrenalina secretada cuando hay estímulos estresantes causa glucogenólisis y las hormonas tiroideas.

Al ascenso de la glucosa sanguínea por arriba de 120 mg/dl se denomina hiperglucemia y puede ser signo de muchas enfermedades, la hiperglucemia siempre se da después de una comida pero se regula por medio de la insulina que lleva la glucosa a los tejidos para su almacenamiento ya que es el principal combustible celular.

La hiperglucemia se da por la disminución de la entrada de glucosa a las células, por la disminución de la utilización de glucosa por varios tejidos y por el aumento en la producción de glucosa por el hígado.

La entrada de glucosa a las células la da la insulina, si la glucosa no entra a las células el cuerpo necesita tomar energía de otro lado, por lo general de las grasas, la degradación de las grasas causa cuerpos cetónicos y consecuentemente cetosis, el hígado en este caso aumentaría la producción de glucosa al ver que las células no están recibiendo la suficiente, agravando el problema.

La enfermedad que se caracteriza por hiperglucemia es la Diabetes Mellitus, en este caso la insulina de la persona es de baja calidad o hay total ausencia de ella causando que la glucosa no pueda entrar en las células

La hipoglucemia está presente en el ayuno pero es fácilmente regulada por los procesos gluconeogénicos o glucogenolíticos si existe una buena reserva de glucógeno, se considera una hipoglucemia cuando los niveles de glucosa sanguínea están por debajo de los 60 mg/dl y esta es mucho más peligrosa que la hiperglucemia ya que fácilmente puede causar un choque hipoglucémico con convulsiones y coma por la falta de glucosa para el funcionamiento cerebral.
La principal causa de hipoglucemia es la presencia de insulina en exceso y se puede regular por el glucagón o la adrenalina como se mencionaba en el punto numero uno, ya que son antagónicos.
Las causas principales de la hipoglucemia en una persona sana son muy obvias, como por ejemplo ayunos prolongados, desnutrición, por vómito y diarrea, ejercicio en exceso, etcétera.

En el caso de una persona que se le suministre insulina tendrá que ser muy bien controlada ya que al dársela entra en vastedad y si no hay buenos niveles de glucosa en sangre la insulina en exceso que entró se encarga de la poca glucosa que existe poniendo en riesgo al paciente, causándole una hipoglucemia severa.

Las características de la curva de la glucosa sanguínea después de la administración de una cantidad conocida de glucosa indica la tolerancia a esta.
La diabetes mellitus tipo I se caracteriza por la disminución de la tolerancia a la glucosa debido a la disminución de secreción de insulina en respuesta a la carga de glucosa. Esto se manifiesta por la hiperglucemia, glucosuria y metabolismo de grasas.

La tolerancia a la glucosa disminuye en la diabetes tipo I, en trastornos relacionados con lesión hepática; en algunas infecciones; en la diabetes tipo II, que se acompaña de obesidad y aumentos de concentraciones plasmáticas de ácidos grasos, disminuye la tolerancia bajo la influencia de algunos fármacos; y algunas veces en la arterioesclerosis.

La insulina incrementa la tolerancia a la glucosa; su administración disminuye el contenido sanguíneo de glucosa e incrementa la utilización y almacenamiento hepático de esta. Un exceso de insulina puede producir hipoglucemia intensa y esta resultar en convulsiones y muerte, a menos que se administre glucosa de inmediato.

Las dosis de glucosa utilizada son de 75 g en la mayoría de adultos, 100 g en Diabetes gestacional y los niños reciben 1,75 g/kg de peso. Por lo general se emplean soluciones preparadas y saborizadas estándar. La solución debe estar fría.
En pacientes en embarazo, la indicación para la prueba de tolerancia es una prueba de chequeo positiva con la administración de 50 g de carga de glucosa y una muestra de suero una hora después. Usualmente una prueba positiva está dada por una glucosa mayor de 140 mg/dL.

Determinación de glicemia y Prueba de tolerancia a la glucosa

La razón fundamental para la determinación de la glicemia es el diagnóstico de una serie de alteraciones metabólicas que comparten el fenotipo de hiperglicemia y se denomina Diabetes mellitus. La otra razón importante para determinar glicemia es el diagnóstico de hipoglicemia, la cual se produce por diversas causas, pero en general si no es bien manejada aumenta las posibilidades de desarrollar Diabetes mellitus.

Este método, propuesto por Trinder en 1972, será el empleado en esta práctica para
la determinación de glucosa. La cantidad de colorante generada, y por tanto la absorbancia medida a 505 nm, será directamente proporcional a la cantidad de glucosa.

Prueba de la tolerancia de la Glucosa

Los métodos más utilizados más comúnmente para evaluar la tolerancia a una sobrecarga de glucosa pueden ser:
1. Pruebas de tolerancia utilizando una dosis única oral de glucosa.
2. Pruebas de tolerancia con una dosis intravenosa de glucosa.

La prueba más común de tolerancia a la glucosa es la oral. Después de una noche de ayuno, el paciente ingiere una solución que contiene una cantidad conocida de glucosa. Se toma una muestra de sangre basal, antes de que el paciente ingiera la solución de glucosa y de nuevo cada 30 minutos después hasta por 2 ó 3 horas, según la solicitud del médico, para la determinación de glicemia. Además, el paciente no puede comer durante el examen y se recomienda informar al médico acerca del uso de medicamentos que pueden afectar los resultados del examen.
Cuando se suministra la glucosa por boca, la absorción desde el tracto gastrointestinal hacia la sangre continúa durante un lapso variable, que depende de la cantidad de glucosa suministrada. La máxima absorción de glucosa se estima en 0,8 g/kg de peso por hora.

La tolerancia a la glucosa suministrada por vía oral, mide el balance entre la velocidad de pasaje de la glucosa al fluido extracelular y su separación por la asimilación celular y la excreción urinaria, si la hubiere.

Por tanto, la prueba puede influirse no sólo por aquellos factores vinculados con la utilización de la glucosa, sino también por los que influyen en su absorción.
EI ayuno previo debe ser de 8 a 9 horas. La dosis de glucosa utilizada es de 75 g. Por lo general se emplean soluciones preparadas y saborizadas estándar. La solución debe ser fría.

Se recoge sangre venosa antes de la ingesta de la glucosa y cada media hora o cada hora durante 3 horas después de la ingesta del azúcar, según la solicitud del médico tratante para la determinación de las glicemias

Utilidad de la glucemia en el diagnostico medico

- Afecciones propias o no del metabolismo de la glucosa
- Diagnostico de diabetes mellitas
- Diagnostico de hipoglucemias
- Deterioro del metabolismo de la glucosa

Criterios para el diagnóstico de diabetes mellitus

-Síntomas clásicos de diabetes (poliuria, polidipsia, pérdida de peso) y prueba al azar de glicemia (sin tener en cuenta el momento de la última comida) mayor o igual a 11.1 mmol/L (200 mg/dL).
- Glucosa plasmática en ayunas (sin comer por 8 horas) mayor o igual a 7 mmoles/L (126 mg/dL).
- O durante una prueba de tolerancia, glucosa a las dos horas mayor o igual a 11.1 mmol/L (200 mg/dL).

La positividad de alguno de estos tres criterios debe ser reevaluada mediante exámenes en una segunda oportunidad.

En condiciones normales la sangre en ayunas debe tener un nivel de glucosa inferior a 100 mg/dl.

Los valores sanguíneos normales son:
-Ayunas: 60 a 100 mg/dl
-1 hora: menos de 200 mg/dl
-2 horas: menos de 140 mg/dl.
-Entre 140 y 199 se considera que existe intolerancia a la glucosa y es un grupo que tiene mayor riesgo de desarrollar diabetes.
-Los niveles por encima de 200 mg/dl indican un diagnóstico de diabetes.


Los criterios utilizados para definir la condición de anormalidad de una curva de tolerancia, se basan en el nivel o pico elevado alcanzado por la concentración sanguínea y la falta de retorno al nivel normal, 2 horas después de la ingestión de glucosa, siendo este último el más importante.
Un valor hipoglucémico (bajo de glicemia) de 3 a 5 horas después de la ingestión de la glucosa se observó en ciertos pacientes cuya curva de tolerancia era de tipo diabético, interpretándose un hiperinsulinismo, típico del estado diabético.

Preparación de la persona para una prueba de tolerancia

-El paciente no debe fumar debido a la estimulación de la glucosa por la nicotina.
-Debe tener un ayuno de 10 a 12 horas antes de la prueba.
-Hay muchas drogas que pueden causar interferencia, entre ellas están esteroides, anticonceptivos orales, diuréticos, antihipertensivos, anticonvulsivantes, drogas psicoactivas y algunos antinflamatorios.

Condiciones de la muestra

-Las evaluaciones de glucosa se realizan en suero o plasma
-Con tubo seco o de tapa roja.
-Se toma por lo menos un volumen de 1 mL (niños 0.5 mL).
- Temperatura Ambiente: 72 horas; refrigerado a 4 oC: 7 días; congelado a -20 oC: 2 meses.

-Tomar una muestra de suero o plasma recogidos mediante procedimientos estándar. El paciente por vía oral tomar los 75ml de la solución glucosada una vez después de tomarle la muestra basal (0hra), y posterior en cada 30 minto tomar las restantes muestras. El suero o plasma deben separarse de los elementos celulares lo antes posible para evitar la glucolisis. La adición de fluoruro sódico a la muestra de sangre previene la glucólisis.
La glucosa en suero o plasma es estable 5 a 7 días a 2-8 ºC; congelado a -20 oC: 2 meses. Los anticoagulantes como la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro no interfieren.

La recolección para una prueba de tolerancia se hace: Después de tomar muestra de suero en ayunas, administrar una solución de glucosa oral. Posteriormente se extraen muestras de suero a los 30, 60, 90 y 120 minutos. Durante el examen el paciente debe permanecer sentado y no consumir nada después de la administración de la solución de glucosa. La actividad física debe ser minimizada. Pueden presentarse vómito o diarrea después del examen.

Contraindicaciones

-Paciente que no esté en ayunas, paciente bajo condiciones de estrés (después de una cirugía, o infección o con corticosteroides).
-Una glucosa en ayunas> de 140 mg/dL en dos ocasiones o una glicemia post-prandial mayor de 200 mg/dL en dos ocasiones en individuos que no están bajo stress, indican una diabetes mellitus, por esta razón está contraindicada la realización de la curva de tolerancia.
-La excesiva hormona de crecimiento, las hormonas adrenocorticales y tiroideas, y las catecolaminas pueden disminuir la tolerancia a la glucosa.

Interferencias: la hemoglobina (> 3 g/L), la lipemia (trigliceridos >1,25 g/L) y la bilirrubina (10 mg/dL) interfieren.

Consideraciones especiales

Factores que interfieren:

-Estrés agudo (por ejemplo, por una cirugía o una infección)
-Ejercicio vigoroso
-Ansiedad
-Enfermedades como hepaticas, hormonales, intestinales…
-Cigarrillo
Algunos medicamentos pueden producir intolerancia a la glucosa, entre otros:
-Los diuréticos
-Los betabloqueadores (como el propanolol)
-Los anticonceptivos orales
-Los corticosteroides (como la prednisona)
-Algunos medicamentos psiquiátricos

Fundamento del método

Determinación de glucosa (método glucosa - oxidasa)

La glucosa presente en la muestra origina, según las reacciones, un complejo coloreado que se cuantifica por espectrofotometría.

Glucosa + ½ O2 + H2O==Glucosa oxidasa== Glucónico + H2O2
2 H2O2 + 4 – Aminoantipirina + Fenol Peroxidasa Quinonaimina + 4 H2O

El peróxido de hidrógeno liberado reacciona con un cromógeno (fenol/4-aminoantipirina) por la reacción de Trinder, para dar una quinona que absorbe entre 492 y 550 nm. La intensidad de color producida es directamente proporcional a la concentración de glucosa.

Puede analizarse por este método cualquier muestra: suero libre de hemólisis, plasma, líquido cefalorraquídeo, orina, un hidrolizado de muestras de hígado para valorar glucógeno etc.

Reactivos

-Reactivo Trinder: Disolución que contiene todos los reactivos necesarios para la determinación de la glucosa

-Disolución patrón de glucosa 0,01

Procedimiento

-Pipetear en tubos de ensayo como se indica en la tabla: tubos marcados como: blanco, estándar y muestras, los reactivos indicados

Reactivos----- Blanco----- Estándar----- Problema--------
Estándar----------------------------------- 20 μL--------
Muestra ------------------------ 20 μL-------------------
Reactivo--------2 mL----------- 2 mL--------- 2 mL----

Concentración Estándar (glucosa, 100 mg/dL)

-Agitar bien e incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente (30-37 ºC)
- Ajustar el espectofotómetro a cero de absorbancia (DO) a la longitud de onda de 500 nm y utilizando el tubo blanco, y leer los tubos restantes . Leer la absorbancia (A) del Patrón y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco.
El color es estable durante al menos 2 horas.

Cálculos

Con los valores de absorbancia (DO) del estándar y de los tubos problema se puede calcular la concentración de glucosa en la muestra.

DO problema x concentración estándar
Conc. problema = X
DO estándar= 100 mg/Dl
Conc= Factor de calibración x lectura (Abs)

Valores normales

Suero o plasma: 70 - 116 mg/ dL
L.C.R.: 50 - 70 mg/ dL
Orina: No contiene, en condiciones fisiológicas normales.

Aunque la glucosa puede determinarse por métodos químicos, estos en su mayoría carecen de especificidad y no pueden distinguir la glucosa de otros monosacáridos. Tanto en análisis clínicos como en la industria alimentaria se utilizan métodos enzimáticos para la determinación de glucosa. Así la glucosa oxidasa es una flavoproteina altamente específica que cataliza la oxidación de la glucosa a β-Dgluconolactona, sin que ningún otro azúcar natural reaccione en extensión apreciable.

Valores normales

------------------ADA-------------------OMS--------------NDDG----------- Tiempo-------------------------------PTGO 75g---------------------------
Ohra…………….95mg/dl……………………………….........................105mg/dl..………..
1hra…………….180mg/dl…………………….....................................190mg/dl..............
2hra…………….155mg/dl……….........…140mg/dl…….................165mg/dl..............
3hra…………....140mg/dl……………………………............................145mg/dl….……..

ADA: American diabetes association
OMS: Organización mundial de la salud, consenso europeo
NDDG: Diabetes data group

Grafica de la tolerancia de la glucosa oral

Resultados

PTGO

Nombre y apellido: Rosangel Grüber
Edad: 22 años

Resultados Glucemia --------Unidades

0hra==91================mg/dl
1hra===184============== mg/dl
2hra===258============== mg/dl
3hra===142============== mg/dl

Valores de referencia

---------------ADA----------------------------NDDG--------
Ohra…………….95mg/dl………………………………105mg/dl…………
1hra…………….180mg/dl……………………...........190mg/dl..............
2hra…………….155mg/dl……………… …….…… …….165mg/dl.........
3hra…………....140mg/dl……………………………..145mg/dl………....

Fecha: 16/06/08

La PTGO 75g realizada a la paciente Rosangel Grüber fémina de 22a, según los valores de referencia de ADA - NDDG y los resultados obtenidos para la hora cero o basal, antes de ingerir la solución glucosada las concentraciones de glucemias si corresponden, al igual para la 1hra se encuentra dentro de los valores de referencia establecidos por las asociaciones, pero ya para la 3 hra las concentraciones de glucemia superan los valores de referencias de ambas agrupaciones cuya concentración de 258mg/dl es muy alta a la que debiera corresponder para esta hora. Aunque para la ultima determinación la glucemia baja y se ubica dentro de los valores de referencia de la NDDG.

Sin embargo el metabolismo de la glucosa de esta paciente esta normal, no sugiere alteración alguna del metabolismo de la glucosa

La prueba de tolerancia a la glucosa en ayunas es la forma más simple y rápida de medir la glucosa en la sangre y diagnosticar la diabetes. El diagnóstico de diabetes se hace en una persona si su nivel de glucosa en la sangre es de 126 mg/dl o superior en dos pruebas separadas.

Durante la prueba oral de tolerancia a la glucosa se examina la presencia de ésta en la sangre dos horas después de beber 75 gramos de dicha glucosa. A la persona se le diagnostica diabetes si su nivel de glucosa (se mantiene) en la sangre es de 200 mg/dl o superior.

Bibliografía

=D. Barham, P. Trinder; Analyst,1972, 97, 142-145