Enzima cardiaca

Universidad de Oriente

Núcleo Bolívar

Escuela de Ciencias de la Salud “Francisco Battistini Casalta”

Laboratorio de Bioquímica Clínica.

Perfil Enzimático para la valoración del Infarto Agudo de Miocardio

Determinación de CK.MB

Bachiller: Angélica González

Profesor: German Guzmán

Cuidad Bolívar, Junio del 2008

Índice

Introducción…02

Fundamento del método…03

Reactivos provistos…03

Instrucciones para su uso…03

Precauciones…04

Instrucciones de almacenamiento…04

Muestra…04

Material requerido…04

Condiciones de reacción…04

Procedimiento…04

Calculo de resultado…04

Valores de referencia…05

Resultado…05

Bibliografía…05

Introducción

La creatina quinasa es una enzima dimérica compuesta por dos tipos de subunidades monoméricas, M (Muscular) y B (Cerebral). Las subunidades se combinan para formar tres isoenzimas CK distintas, CK-BB (CK-1), CKMB (CK-2) y CK-MM (CK-3). CK MM es la forma predominante de CK en los músculos esqueléticos. CK-BB se encuentra en el cerebro y en los músculos esqueléticos. CK-MB se encuentra en alta concentración en el miocardio (entre 14 y 42%) y en menor proporción en los músculos esqueléticos. En ausencia de enfermedad, la mayor parte de la actividad de la CK en el suero se debe a la isoforma CK-MM.

Los daños en el miocardio, como los presentes en el infarto de miocardio agudo (IMA), tendrán como resultado un aumento de los niveles circulatorios de la isoforma CK-MB.

Generalmente los niveles de CK-MB aumentan entre 4 y 6 horas después de la aparición del dolor de pecho, alcanzando un pico entre las 12 y 24 horas y volviendo a los niveles iniciales antes de 48 horas. En los casos en los que existan sospechas de un IMA; se recomienda la determinación de CK-MB, generalmente en el momento del ingreso y 6 horas, 12 horas y 24 horas más tarde.

Se encuentran disponibles varios métodos para la separación y cuantificación de CK-MB mediante electroforesis e inmunoinhibición. Los métodos de inmunoinhibición presentan la ventaja de que se pueden automatizar fácilmente. El método CK-MB de Thermo Scientific utiliza un método de inmunoinhibición. El reactivo contiene una mezcla de anticuerpos monoclonales al monómero CK-M y así inhibe por completo la actividad de CK-MM y la mitad de la actividad de CK-MB. Se mide la actividad de la subunidad monomérica B no inhibida de CK-MB, la cual representa la mitad de la actividad de CK-MB. El método asume que la actividad de la isoenzima CK-BB en suero es prácticamente cero. En este método, se añade suero a un reactivo de CK-NAC modificado que contiene el anticuerpo anti-M.

Durante la incubación inicial tienen lugar las siguientes reacciones:

CK-MM + anticuerpo ————> CK-MM inhibida

CK-MB + anticuerpo ————> CK-MB inhibida al 50%

Fundamento del método

Método UV para la determinación de la isoenzima MB de cretina kinasa en suero o plasma mediante anticuerpos monoclonales anti CK-M

El método se basa en la inhibición específica de las unidades CK- M con anticuerpos monoclonales anti CK- M, los anticuerpos inhiben tanto la isoenzima MM como las subunidades M correspondientes a CK- MB. Las subunidades B se determinan mediante el empleo de un sistema reactivo basado en una técnica analítica optimizada por la IFCC, con N acetilcisteina como activador adicionado de anticuerpos monoclonales anti CK- M.

Reactivos provistos

-Buffer: solución de buffer imidazol, 100 mmol/l, pH 6,7

-Sustratos viales: para determinaciones individuales conteniendo cantidades suficientes una vez reconstituido.

-Suero control: vial conteniendo suero liofilizado.

Instrucciones para su uso

-Buffer: listo para usar.

-Sustrato: agregar 2,5 ml de buffer a un vial de sustrato. Agitar y etiquetar.

-Suero control: pipetear 1 ml de agua destilada y agregar al vial de suero liofilizado. Tapar y esperar 5 minutos para su uso.

Precauciones

-Los reactivos son para uso in Vitro.

-Suero control: debe ser tratado como material infectivo, a pesar de que ha sido analizado para HIV y HBV siendo no reactivo.

Instrucciones de almacenamiento

-Reactivos provistos: estables en refrigerador 2-10º C, hasta la fecha de vencimiento

-Sustrato reconstituido: refrigerado de 2-10º C, es estable 3 días a partir del momento de su reconstitución

-Suero control reconstituido: estable 3 días refrigerado 2-10º C, 2 días a 25º C o 3 meses congelado -20º C. No congelar y descongelar repetidamente.

Muestra

-Suero o plasma

-Si se utiliza plasma se debe utilizar heparina o EDTA como anticoagulante, o el empleo de anticoagulante W de Wiener Lab.

-Interferencia: sueros con hemolisis producen valores falsamente aumentados.

Material requerido

-Espectrofotometro.

-Micropipetas y pipetas.

-Baño de maría.

-Cronómetro.

Condiciones de reacción

-Longitud de onda: 340 nm, 334 o 366 Hg.

-Temperatura de reacción: 25, 30 o 37 ºC.

-Tiempo de reacción: 15 minutos.

Procedimiento

Sustrato reconstituido-------------------------------- 2,5 ml

Pre- incubar por unos minutos.

Muestra---------------------------------------------- 0,10 ml

-Mezclar por inversión, esperar 10 minutos.

-Llevar el aparato (Genesis) a 0 con agua destilada.

-Seleccionar la longitud de onda y la temperatura de reacción.

-Registrar las absorbancias cada minuto (disparar el cronómetro) durante 5 minutos.

-Determinar la diferencia promedio.

Cálculos de los resultados

CK- MB (U/L) = Delta D Abs/min* Factor

Medida a 340 nm = CK- MB (U/L) = Delta D Abs/min* 8254

Medida a Hg 334 = CK- MB (U/L) = Delta D Abs/min* 8414

Medida a Hg 366 = CK- MB (U/L) = Delta D Abs/min* 14858

Los valores mencionados ya tienen la corrección para convertir los valores de CK- B en CK- MB

Se trabajo manual con el génesis a 25ºC

1º minuto= 0,157 Abs

2º minuto= 0,159 Abs

3º minuto= 0,170 Abs

4º minuto= 0,172 Abs

5º minuto= 0,173 Abs

Delta Abs

1 = 0,173 - 0,172 = 1 x 10^-3

2 = 0,172 – 0,170 = 2 x 10^-3

3 = 0,159 – 0,157 = 2 x 10^-3

Delta Abs/ minuto = (1 + 2 + 2) x 10^-3/ 5 = 5 x 10^-3 = 1x10^-3 * 8254 = 8 U/L

Valores de Referencia

Temperatura: 25 ºC----------------------------- 30 ºC ------------------------- 37 ºC

Valores: 10 U/L--------------------------- 16 U/L------------------------ 25 U/L

Resultados

Nombre y Apellido: Fanny R

Edad: 23a

Valores Obtenidos CK-MB ------------valor--------unidades-----------valor de referencia

CK-MB----------------------------------8-------------U/L 25ºC--------10U/L 25ºC

La creatina quinasa ( CK ) es una isoenzima presente en el músculo ( CK-M ) y en el cerebro
(CK-B), y existe en el suero en forma de dimeros como CK-MM, CK-MB, CK-BB, y macroenzimas. La determinación de CK-MB es bastante específica para la confirmación de daños en el músculo cardíaco, siendo que la CK-BB está prácticamente ausente del suero y la CK-MM es abundante, dado su origen muscular.

Así la CK-MB es clínicamente utilizada para el diagnostico y monitorización de infarto de miocárdico. Y los resultados obtenidos en la dertminacion de CK.MB para la paciente fanny R, fue de 8U/L cuyo valor esta dentro de los valores de referencia (10U/L 25ºc) de CK.MB

La reacción para CK-MB consiste en la determinación directa de la actividad enzimático de la CK-B, después de la inhibición especifica de sus subunidad CK-M , en la CK-MM, i CK-MB. Esta inhibición se consigue a través de la unión de anticuerpos policlonales específicos del reactivo, que bloquean el sitio activo de la enzima, inhibiendo así su actividad.

En algunas ocasiones, debido a la naturaleza de la muestra analizada, y la composición del reactivo, los resultados pueden sufrir interferencias por reacciones inespecíficas con la subunidad CK-B.

Estas interferencias (sueros lipemicos, hemolizados…) generan resultados alterados, y no muestran el mejor comportamiento de la determinación.

Bibliografía

-Inserto CK- MB NAC. Unitest. Monoclonal. Wiener Lab 2000. Rosario- Argentina