sábado, 28 de junio de 2008

Perfil lipidico


Universidad de Oriente

Núcleo Bolívar

Escuela de Ciencias de la Salud “Francisco Battistini Casalta”

Laboratorio de Bioquímica Clínica.






Perfil lipídico




Bachiller: Angélica González

Profesor: German Guzmán

Cuidad Bolívar, Junio del 2008




Índice

Introducción…02

Fundamento del método…03

Reactivos…04

Material requerido…05

Muestra…08

Sustancias interferentes…10

Limitaciones del método…13

Procedimiento…13

Calculo de resultado…14

Resultado…15

Bibliografía…16


Introducción


El perfil lipídico lo constituye la cuantificación analítica de una serie de lípidos que son transportados en la sangre por los diferentes tipos de lipoproteínas plasmáticas. La determinación de estos parámetros es un procedimiento analítico básico para el diagnóstico y seguimiento de enfermedades metabólicas, primarias o secundarias. Entre estos parámetros analíticos que se pueden determinar están: el colesterol total, el colesterol transportado por las LDL, el colesterol transportado por las HDL, los triglicéridos totales, ciertas apoproteínas particulares etc.


El perfil lipídico incluye el colesterol total, el HDL-colesterol, el LDL-colesterol y los triglicéridos. Algunas veces, el informe incluirá valores adicionales calculados como la relación HDL/colesterol o cálculos basados en los resultados del perfil lipídico, edad, sexo y otros factores de riesgo.

La cuantificación de colesterol y triglicéridos en suero es un procedimiento analítico básico en el diagnóstico y seguimiento de enfermedades metabólicas, primarias o secundarias. Altos niveles de colesterol se asocian a riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares. En esta práctica se realizará la determinación en suero de colesterol total, colesterol-HDL y triglicéridos.

Altos niveles de colesterol se asocian a riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares, en especial aquel unido a las LDL (colesterol malo). El colesterol de las HDL (colesterol bueno), puesto que representa aquella fracción de colesterol que se transporta al hígado para su metabolización y excreción por vía biliar, no se asocia con riesgo de enfermedad.

Los objetivos de la práctica son la determinación en suero de colesterol

Los triglicéridos son el principal tipo de grasa transportado por el organismo. Recibe el nombre de su estructura química. Luego de comer, el organismo digiere las grasas de los alimentos y libera triglicéridos a la sangre. Estos son transportados a todo el organismo para dar energía o para ser almacenados como grasa.

El hígado también produce triglicéridos y cambia algunos a colesterol. El hígado puede cambiar cualquier fuente de exceso de calorías en triglicéridos.

Los niveles de triglicéridos varían con la edad, y también dependen de qué tan reciente ingirió alimentos antes del examen. La medición es más precisa si no se ha comido en las 12 horas previas al examen. El valor normal es de 150 mg/dL. Para quienes sufren problemas cardiacos, los niveles de esta sustancia deben ser inferiores a los 100 mg./dl.

Los triglicéridos altos además se encuentran presentes en los alimentos y en la sangre.

Si el colesterol tiene un valor normal, un nivel elevado de triglicéridos no parece ser un factor de riesgo de enfermedad cardiaca, pero sí puede ser riesgoso al asociarse con diabetes y pancreatitis.

Cuando la persona come, los triglicéridos se combinan con una proteína en su sangre para formar lo que se llama lipoproteínas de alta y baja densidad. Estas partículas de lipoproteínas contienen colesterol. Para formar triglicéridos en el hígado el proceso es similar; el hígado toma los carbohidratos y proteínas sobrantes de la comida y los cambia a grasa. Esta grasa entonces se combina con proteína y colesterol para formar lipoproteínas de muy baja densidad, que son liberadas al torrente circulatorio.

Los objetivos de la práctica son la determinación en suero de colesterol total, HDL-Colesterol y triglicéridos, para lo que se utilizarán kits comerciales



Determinación de colesterol total

Fundamentos del Método.

Inserto de la Casa Comercial Laboratorios Biogamma C.A.

Colesterol Total.

Para la determinación de colesterol total se utilizan reactivos comerciales que incluyen las enzimas y sustratos necesarios para la cuantificación de todas las formas de colesterol presentes en el suero (Kit comercial de Biogamma C.A. Colesterol Total.

La determinación del colesterol total esta basado en el procedimiento enzimático (descrito por Allan):

Colesterol esterasa

Esteres de colesterol=====Colesterol Libre + Ácidos Grasos

Colesterol oxidasa

Colesterol Total + Oxigeno=====Colest- 4- en -3- one + H2O2

Peroxidasa

Fenol + 4-aminoantipirina + 2 H2O2=====Cromoforo de quinoneimina + 4H2O


Reactivos usados

-Reactivo enzimático. Contiene: 4- aminoantipirina, Fenol, Colesterol Estearasa, Colesterol Oxidasa, Peroxidasa, activadores, estabilizadores y Buffer. Condiciones: refrigerado entre 4-8 ºC.

-Estándar de Colesterol (200 mg %): es una solución de colesterol monometil etilenglicol, y activadores. Condiciones: refrigerado entre 4-8 ºC, o a temperatura ambiente (25 ºC)

Precaución: las soluciones de estándar son venenosas si son absorbidas a través de la piel y muy peligrosa si se inhalan sus vapores. Lave las manos vigorosamente después de su uso.

Muestra.

-Suero recién extraído y no hemolizado. También se pueden usar plasma obtenido con EDTA.

El colesterol en suero o plasma es estable:

-Por 5 día a temperatura ambiente.

-2 semanas refrigeradas

-6 meses si se congela.

Recomendaciones: Un ayuno de 12-14horas antes de la extracción de la muestra, sobre todo si también se le va hacer la determinación de triglicéridos a la misma muestra. Sin no cumplen este requisito no deben usarse para determinar colesterol y HDL-Colesterol.

Limitaciones del Método.


-Niveles de ácido ascórbico tan altos como 10 mg %, No Interfieren en la prueba

-El presente método de Colesterol, á demostrado ser lineal hasta 500 mg/dl. Mas allá de este límite, las muestras deberán diluirse con solución salina (0,85%) y ensayadas nuevamente. El nuevo resultado deberá multiplicarse por el factor de dilución

Procedimiento del método.

-Marcar 3 tubos: Tubo 1 para la muestra (M), Tubo 2 para el estándar de referencia (ER) y Tubo 3 para blanco reactivo (BR).

-A cada tubo (1, 2 y 3) agregar 1 ml de reactivo de colesterol.

-Pipetear 0,010 ml de la muestra y agregar al tubo 1. Tape y mezcle por inversión.

-Pipetear 0,010 ml de estándar de colesterol total y agregar al tubo 2. Tape y mezcle por inversión.

-Pipetear 0,010 ml de agua destilada y agregar al tubo 3. Tape y mezcle por inversión.

-Incubar todos los tubos a 37 ºC por 5 minutos en baño de maría, o 15 minutos a temperatura ambiente.

-Después de incubar, mezclar por inversión cada tubo y lea en el espectrofotómetro dentro de los 30 minutos siguientes.

-Leer a 500 nm, llevar a 0% abs., con el blanco reactivo. Leer el tubo 1 y 2 y anotar las Absorbancias. (esto dependerá del equipo utilizado, algunos dan las concentraciones del analito en estudio).

-Se utilizo un aparato manual (génesis)

Nota: control de calidad se recomienda el uso de sueros controles normales y anormales, comerciales de calidad reconocida.


----------------Muestra------------Estándar-----------Blanco reactivo

Muestra-----0.010ml------------------------------------------------------

Estándar----------------------------0.010ml-------------------------------

Reactivo--------1ml-------------------1ml-----------------1ml-----------

colesterol

Determinación de HDL-colesterol

Para la determinación del colesterol presente en las principales lipoproteínas que lo contienen como HDL (lipoproteínas de alta densidad) y LDL (lipoproteínas de baja densidad), es necesario:

1, la separación selectiva de la lipoproteína correspondiente con agentes precipitantes.

2, la cuantificación del colesterol presente en dicha lipoproteína como se indicó anteriormente.

Este es un procedimiento de separación únicamente, para determinar los valores de HDL colesterol, se debe utilizar 0.050ml del sobrenadante obtenido por este procedimiento del colesterol total

-Pipetear 0.5ml de la muestra y agregar en un tubo

-Agregar 0.05ml de reactivo precipitante

Entre estos reactivos precipitantes están el ácido fosfotungstico y magnesio que precipitan a las LDL y VLDL (lipoproteínas de muy baja densidad) mientras que las HDL permanecen en solución

-Agitar vigorosamente

-Reposar en el refrigerador por 15 minutos

-Centrifugar por 10 minutos entre 3500-4000rpm

-Y del sobrenadante tomar los 0.050 ml de muestra para determinarle HDL= colesterol

Esquema de trabajo

----------------Muestra------------Estándar-----------Blanco reactivo

Muestra-----0.050ml------------------------------------------------------

Estándar----------------------------0.050ml-------------------------------

Reactivo--------1ml-------------------1ml-----------------1ml-----------

Colesterol

Mezclar e Incubar 5 min a 37ºC (ó 10 min a temperatura ambiente).

Leer la absorbancia a 505 nm.


Determinación de triglicéridos

Para la determinación de triglicéridos en suero se utilizan reactivos comerciales (Kit comercial de CHEMROY) que incluyen las enzimas y sustratos necesarios para la cuantificación por espectrofotometría visible.

Fundamento del método

Para la determinación colorimetrica cuantitativa enzimático de triglicéridos en suero o plasma

Para establecer el diagnostico de hiperlipoproteinemia primaria o secundaria, es muy útil la cuantificación de triglicéridos en conjunto con otros lípidos.

También es útil para dar seguimiento a la diabetes mellitus, nefrosis, obstrucción biliar y varias anormalidades metabólicas que resultan de disturbios endocrinos


Las reacciones que tienen lugar son:


Lipasa

Triglicéridos + H2O=====Glicerol + Ac. Grasos

GK

Glicerol + ATP====Glicerol-3-P + ADP

GPOD

Glicerol-3-P + O2====Dihidroxiacetona + H2O2

POD

H2O2 + p-clorofenol + 4-AP====Quinona + H2O

1. Una lipasa hidroliza los triglicéridos dando glicerol mas ácidos grasos libre.

2. El glicerol formado es sustrato de una glicerol quinasa que en presencia de ATP lo f osforila a glicerol 3P.

3. El glicerol 3P es oxidado a dihidroxiacetona por una glicerol fosfato oxidasa dando también peróxido de hidrógeno.

4. El peróxido de hidrógeno junto con los cromógenos p-clorofenol y 4-AP son sustrato de una peroxidasa para formar una quinona roja cuantificable a 505 nm. La quinona formada es proporcional a la concentración de triglicéridos presente en la muestra.

Reactivo

-Triglicéridos reactivo

-Triglicéridos activador

-Estándar triglicéridos 200 mg/dl

Precauciones

-Uso de diagnostico in Vitro

-Los reactivos y el estándar contienen azida de sodio como conservador


Material requerido

-Espectrofotómetro

-Baño de maria a 37’C

Muestra

-La heparina y EDTA son los anticoagulantes de elección.

-No deben usarse fluoruros ni oxalatos. Separa el suero o el plasma

-Los TG son estables por 10 días a 2-8’C

-No deje las muestra a temperatura ambiente, ya que los fosfolipidos pueden hemolizarse liberando glicerol libre, falsamente aumentados los TG


Sustancias interferentes

-No debe usarse material que contenga glicerina

-Muestras hemolizadas

Procedimiento

Esquema de trabajo

----------------Muestra------------Estándar-----------Blanco reactivo

Muestra-----0.01ml------------------------------------------------------

Estándar----------------------------0.010ml-------------------------------

Reactivo--------1ml-------------------1ml-----------------1ml-----------

Mezclar e Incubar a 37ºC 5 min (ó 10 min a temperatura ambiente). Leer la absorbancia a 505 nm de la Mx y St

Nota: Control de calidad se recomienda el uso de sueros controles normales y anormales, comerciales de calidad reconocida

Calculo de los resultados

Datos

Conc ST colest = 200mg/dl

Abs ST colest = 0.153 Abs

Abs Mx colest= 0.112Abs

Conc ST HDL-C= 50mg/dl

Abs ST HDL-C= 0.284 Abs

Abs Mx HDL-C= 0.136 Abs

Abs ST TG= 0.280 Abs

Abs Mx TG= 0.150 Abs

Determinacion de colesterol total

Conc Mx (mg/dl)= Conc. ST/Abs. ST*Abs Mx

Conc. Mx (mg/dl)= 200mg/dl/ 0.153*0.112 = 147 mg/dl

Determinacion de HDL-C

Conc HDL-C = Conc ST/Abs ST*Abs Mx

Conc HDL-C= 50mg/dl/0.284*0.136= 24 mg/dl

Determinación de VLDL-C

VLDL-C= TG/5= 107/5= 21 mg/dl

Determinación de LDL-C

LDL-C= Colest total – HDL- VLDL

LDL-C= (147-24 - 21) mg/dl = 102mg/dl

Colest total= HDL-C + LDL-C + VLDL-C

Colest total= (24 + 21+ 102)mg/dl = 147 mg/dl

Determinación de Triglicéridos

Conce TG sericos = Abs Mx/ Abs St* 200

Conce TG sericos =0.150/0.280*200=107 mg/dl

A partir de tos datos de colesterol total, triglicéridos y colesterol HDL fueron calculados colesterol VLDL y colesterol LDL


Valores normales colesterol total

Deseable menos de 200 mg/dl

Limite alto: 200-239mg/dl

Alto: 240 o por encima mg/dl

Resultados

Paciente 001

Edad: 29 a

Sexo: femenina

Perfil lipidico

==========Valor obtenido =========Unidades============Valor de referencia

Colesterol total=== 147 ==============mg/dl ===============150-250 mg/dl

Triglicéridos===== 107 =============mg/dl ================50-140 mg/dl

VLDL-C ======= 21 ==============mg/dl ================16- 36mg/dl

LDL-C ======== 102 =============mg/dl ================83-140mg/dl

HDL-C ======== 24 ============= mg/dl ================39- 43mg/dl

Laboratorio de bioquímica clínica

El perfil lipidico realizado a la paciente femenina de 29años de edad dio como resultados valores que están dentro de los intervalos de referencia de colesterol total, triglicéridos, VLDL, LDL y HDL-C. Siendo el perfil lipidico de esta paciente normal. Estando el colesterol dentro de los valores esperados menos de 200mg/dl

Teniendo en cuenta que los valores de referencia sin hacer discriminaciones por edad son: Sexo Femenino de HDL, LDL y VLDL-C están dentro de los valores esperados

Las determinaciones de lipoproteínas de baja densidad (LDL) se utilizan como herramientas diagnósticas en la evaluación del riesgo de cardiopatía coronaria.

Existe variabilidad de los diferentes componentes del perfil lipídico en relación a la edad y sexo. De allí la importancia de que en el estudio de cada individuo sean tenidas en cuenta como mínimo estas dos variables

Bibliografía.

-Inserto de Laboratorios Biogamma C.A. Química Sanguínea. Caracas- Venezuela: Edif. Frangiu, La Trinidad, Calle Bolívar No. 27 1er piso, local 1-A. TLF:945. 80. 24. E-mail: Biogamma@ cantv. Net

-Inserto de Laboratorios CHEMROY. Triglicéridos proced.No. CR315